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        无需RNA纯化,生物样本直接qPCR—多种病原菌检测实例
         
        2019年,Takara发布了无需RNA提取,可直接使用生物样本进行定量PCR的新产品PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix (or with UNG)(Code No.RR650/651)。
         
         
        点击链接,了解德国科学家使用RR650构建不需要RNA提取的快速新冠病毒qPCR检测新方法。
         
        下面介绍一下使用直接qPCR方法进行甲流病毒、金黄葡萄球菌、寨卡病毒检测的实验例。
         
        实验例1 甲型H1N1流感灭活病毒的检测
        我们使用PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix直接对生物样本进行H1N1检测。
         
        实验样本
        将灭活甲型流感病毒以2×100-102 copies/μl的浓度加入口腔拭子样本、鼻拭子样本和唾液样本中。
         
        检测样本 说明
        口拭子   将取样的口拭子浸泡在200 μl PBS缓冲液中,摇匀5秒,然后向反应液中添加1 μl上清液。
        鼻腔拭子   将取样的鼻腔拭子浸泡在200 μl PBS缓冲液中,摇匀5秒,然后向反应液中添加1 μl上清液。
        唾液   直接向反应液中添加1 μl上清液。
         
        反应体系
        组分 液量(μl)
          PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix (2X) 12.5 μl
          Forward Primer (10 μM) 0.5 μl
          Reverse Primer (10 μM) 0.5 μl
          qPCR probe (10 μM) 0.5 μl
          样本 1 μl
          甲型流感病毒H1N1 (2×100-102 copies/μl) 1 μl
          RNase Free H2O 9 μl
          Total 25 μl
         
        反应结果
        扩增曲线如下图,鼻腔拭子和唾液样本的检测灵敏度为20拷贝,口腔拭子样本的检测灵敏度为2拷贝。
         
        实验例2 全血中的金黄葡萄球菌检测
         
        实验样本
        全血(肝素血及EDTA血)及其10倍稀释液(PBS)中加入1×101~105 cfu/μl浓度的金黄葡萄球菌。制备好后各使用1 μl。
         
        引物/探针检出范围: 16S rRNA基因(Cy5标记)
         
        反应体系
        组分 液量(μl)
          PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix, with UNG (2X) 25 μl
          Forward Primer (10 μM) 1 μl
          Reverse Primer (10 μM) 1 μl
          TaKaRa qPCR Probe (10 μM) 1 μl
          血液样品(含金黄葡萄球菌) 1 μl
          RNase Free H2O 21 μl
          Total 50 μl
         
        反应条件
          90℃   3 min  
          60℃   5 min  
          95℃   5 sec 40 Cycles
          60℃   30 sec
         
        结论
        虽然使用血液成分进行检出时有阻害,但是PrimeDirect Mix在全血原液中(肝素血、EDTA血)可直接检出100 cfu,其10倍稀释液也可以直接检出10 cfu的金黄葡萄球菌。该实验显示,1 μl全血中如果存在100 cfu的金黄葡萄球菌,可以检出。
         
        实验例3 Zika(寨卡)病毒检测
         
        实验样本
        在尿液及其10倍稀释液(生理盐水)中,加入2×103 copies/μl浓度的NATtrol Zika Virus(ZeptoMetrix公司)制备起始样品,然后各使用1 μl。
         
        引物/探针检出范围: Polyprotein基因(ROX标记)
         
        组分 液量(μl)
          PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix, with UNG (2X) 12.5 μl
          Forward Primer (10 μM) 0.5 μl
          Reverse Primer (10 μM) 0.5 μl
          TaKaRa qPCR Probe (10 μM) 0.5 μl
          尿液样品(含Zika virus) 1 μl
          RNase Free H2O 10 μl
          Total 25 μl
         
        反应条件
          90℃   3 min  
          56℃   5 min  
          95℃   5 sec 40 Cycles
          56℃   30 sec
         
        结论
        PrimeDirect Mix不易受尿原液的阻害,可直接检出尿液中的Zika病毒。
         
        检测灵敏度
        尿原液中分别添加浓度为2×10-2~103 copies/μl NATtrol Zika Virus制备起始样品,各使用1 μl,使用上面相同的反应体系和反应条件。
         
        PrimeDirect Mix不易受尿液阻害,尿液中的Zika病毒2个拷贝以上即可检出。
        感染者的尿液中该病毒RNA浓度为2.1x10 copies/μl的案例也有报道,使用本试剂能够满足检出灵敏度。
        Zika 病毒感染者尿液中病毒RNA浓度的案例:(https://www.niid.go.jp/niid/ja/id/2358-disease-based/sa/zika-fever/7169-zikara-11-170331.html)
         
        我们对全血中Zika病毒检测,也得到了类似结论。
        血液成分对检出虽然有阻害作用,但全血10倍稀释液中的Zika病毒2拷贝以上可以检出。显示出在全血原液1 μl中存在20拷贝左右的Zika病毒时,可以检出。
         

         
        众多实验例充分证明,PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix (or with UNG)(Code No.RR650/651)在直接qPCR检测方面有着良好的表现,血液、尿液、粪便、细胞可以直接进行病毒或细菌的一步法RT-qPCR,大大提高了操作简便性,减少了反应时间,可以简便、低成本地进行qPCR检测。
        另外,Takara基于至今为止积累的技术和经验,提供使用本产品制造基因检测kit的定制生产,提供更适合的Real Time PCR检测试剂。
         
        从基因分析领域的基础研究到产业应用,Takara将持续不断推出各种用途的新产品和服务,从而进一步扩大生物产业支援事业。
         
         
         
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